Нови технологии с приложение в диагностика и дизайн на нови терапии за вродения имунитет
Aвтор Милена Лесева
Генно/геномнo редактиране с CRISPR/Cas
Много от молекулярно-биологичните методи, прилагани в съвременните научно-изследователски лаборатории използват ензими, които учените са изолирали за първи път от вируси и прокариоти или се основават на механизми за клетъчна защита, характерни за бактериалните клетки. Пример са ретровирусната РНК-зависима ДНК полимераза (обратна транскриптаза), бактериалните системи за рестрикция и модификация (рестрикционни ендонуклеази), термостабилните ДНК полимерази (Taq полимераза) и плазмидите (вектори, използвани в молекулярното клониране). Подобен пример са и инструментите за генно/геномно редактиране, каквито са системите CRISPR/Cas.
CRISPR е съкращение от думите clustered regularly interspersed short palindromic repeats. В превод това е: клъстер от къси палиндромни повтори, разположени на равно отстояние едни от други. Това дескриптивно наименование описва същината му–семейство от ДНК локуси в генома на бактерии и археи, състоящи се от консервативни палиндромни повтори, прекъсвани от хипер-вариабилни последователности, наречени спейсери (spacers). Тези спейсери произхождат от уловени и инкорпорирани сегменти на вирусни или други, чужди за клетката, генетични последователности. Те често се разполагат в съседство до cas (CRISPR-associated) гени. Cas гените кодират голямо и хетерогенно семейство протеини с функционални домени, характерни за ендонуклеази, хеликази, полимерази и полинуклеотид-свързващи белтъци. Локусите CRISPR заедно с cas гените формират CRISPR/Cas системите.За тях може да се мисли като за имунитет, придобит след среща на бактериалната клетка с чужда за нея генетична информация. При процеса на „имунизация“, след навлизането на екзогенна ДНК (бактериофаги или мобилни генетични елементи), Cas комплексът я разпознава, отрязва фрагмент от нея и го интегрира в генома във вид на нова единица повтор-спейсер откъм водещия край на CRISPR локуса.Когато клетката отново срещне същата чужда генетична информация локусът CRISPR се транскрибира до pre-crРНК,която се процесира до малка зряла crРНК. Зрялата crРНК се асоциира с един или повече Cas протеина и формира ефекторни комплекси, crRNP. РНК компонентата на тези комплекси ги насочва към чуждата ДНК молекула, а нуклеазната им активност я нарязва, като по този начин я инактивира. Съществува голямо структурно и функционално разнообразие от естествени CRISPR/Cas системи. На базата на асортимента от cas гени и особеностите на crRNP ефекторния комплекс, понастоящем те се групират в шест типа, Type I-VI, всеки от които работи с конкретна Cas ендонуклеаза. Тези типове допълнително са групирани в два големи класа (Class 1 и Class 2).
CRISPR/Cas9 (Class 2, Type II) е най-често използваната система за приложна РНК-насочена генна редакция и транскрипционен контрол на еукариотни клетки в лабораторни условия. Cas9 има за субстрат двойноверижна ДНК, а системата работи чрез първоначално разпознаване на къса (2-5bp) последователност, наречена PAM (proto spacer adjacent motif), която се намира непосредствено до последователността избрана за редакция. След комплементарно сдвояване между “насочваща”РНК (guide RNA) с подходящо подбрана секвенция и таргетната последователност, ефекторният комплекс срязва двете вериги на ДНК. Срязаната ДНК молекула може да бъде поправена чрез хомоложна рекомбинация (в случай, че на клетката се предостави матрица с желаната от изследователя нуклеотидна последователност), или чрез NHEJ, в хода на който се генерират мутации и таргетен ген може, съответно, да се инактивира (Фигура).
Изборът на подход зависи от конкретната експериментална задача и желания краен резултат.Без да сме изчерпателни, ето няколко примера за използване на CRISPR за генна редакция: функционална поправка на хромозомни инверсии в гена за Factor VIII при хемофилия А; функционална поправка на гена CFTR в органоиди от стволови клетки на пациенти с муковисцидоза; въвеждане на мутацията CCR5Δ32 за придобиване на резистентност към инфекция с HIV. Комбинирането на технологията CRISPR с технологията на индуцираните плурипотентни стволови клетки е особено мощен инструмент за изучаване на патогенезата на различни заболявания.
С цел разширяване на приложенията на CRISPR-базирания инструментариум, понастоящем се работи в посока разработването на системи, които могат да разпознават и/или да срязват РНК молекули. Това ще позволи таргетирането както на протеин-кодиращи, така и на некодиращи РНКи (microRNA, lncRNA, snoRNA), чието значение за регулацията на всички клетъчни функции става все по-ясно през последните години.
Генното/геномното редактиране на човешки клетки на организмово ниво повдига редица биоетични въпроси.
Въпреки, че те не са обект на това кратко представяне на технологията CRISPR/Cas в случай, че имате интерес към тази тематика ви препоръчваме доклада:
Human Genome Editing: Science, Ethics, and Governance, A report by the National Academies of Sciences, Engineering and Medicine, USA, 2017.
Допълнителен материал: Terns MP. CRISPR-Based Technologies: Impact of RNA-Targeting Systems. Мolecular cell 2018, Vol 72,404-412. doi.org/10.1016/j.molcel.2018.09.018
Фигурата е изработена от Петя Димитрова с използване на BioRender софтуер.
Автор Калин Стоянов
Платформа на 10xGenomics
Американската компания 10XGenomics представя революционни инструменти за генетичен анализ. Много често при имунологични и хематологични изследвания се изолира определена клетъчна популация и се проследява нейното активиране през определени сигнални пътища, продукция на цитокини или други важни фактори, за да се определят промени, свързани с или водещи до патология. Оказва се обаче, че макар и от еднакъв клетъчен тип във всяка популация има хетерогенност, понеже индивидуалната клетка показва специфичен профил на генна експресия и набор от иРНК. Ето защо 10XGenomics разработват технология за изследване на транскрипцията в индивидуална клетка наречена Single cell gene expression и за едновременно профилиране на индивидуален фенотип на имунни популации наречен Single cell immune profiling.
Single cell gene expression – Профил на генна експресия на индивидуално клетъчно ниво. С този анализ може да се разкрие променливостта на генната експресия срямо индивидуалното фенотипно разнообразие. Може да се използва за:
-
Идентифициране и характеризиране на редки типове клетки
-
Анализиране на клетъчната хетерогенност и съответен биологичен ефект
-
Клетъчно фенотипизиране едновременно с индивидуално секвениране на иРНК (RNA-seq) за идентифициране на нови мишени, биомаркери и типове клетки и състояния
-
Оценка на експресията на иРНК и протеини на клетъчната повърхност в една и съща клетка
-
Едновременно получане на функционални генетични експресионни панели с висока чувствителност в десетки хиляди клетки
Single cell immune profiling – Профилиране на адаптивния имунитет и специфичен репертоар на Т и В лимфоцини. Може да се използва за:
-
Разкриване на клоналност, разнообразие, антигенна специфичност и антигенно представяне
-
Сглобяване на поредица от генетични последователности V (D) J
-
Сдвояване на α и β верижни TCR последователности от отделни Т клетки
-
Сдвояване на тежки и леки вериги имуноглобулинови (Ig) последователности от отделни В клетки с пълно изотипно охарактеризиране
-
Едновременно измерване на TCR, B клетъчен Ig, експресия на протеин от клетъчна повърхност и 5 'генна експресия в същите клетки
-
Свързване на сдвоени TCR α и β верижни последователности със специфичност за комплекс TCR-MHC
Какво прави тази технология уникална?
Уникалносттта на технологията се дължи на комбинирането на Chromiun single cell gene expression с GEM технология.
GEM представляват микрочастици в гел, натоварени с еднакви олигонуклеотиди с определен баркод от 16 нуклеотидни последователности. Баркодовете са индивидуални за всеки GEM. С метода може да постигне разделяне за минути на повече от 100 000 баркода.
Единична клетка или ядро с помощта на ензими се лизира в емулсия, към която се добавя набор от GEM, всяка от които има определен баркод. GEM чрез баркода си разпознава специфичен участък от РНК транскрипт в лизираната клетката или ядро. След това всички GEM-баркод-РНК се събират заедно и към тях се добавя ензима обратна транскриптаза чрез която се извършва RT-PCR. Баркодовете от олигонуклеотиди-РНК служат като матрица върху която се синтезира едноверижна сДНК. При този процес се транскрибира обратно и баркода. Така след това се генерират cДНК библиотеки, които се групират според баркода, подлагат се на секвениране и анализ. Например така могат да се изготвят стандартни VDJ библиотеки за всяка индивидуална Т и В клетка от които се генерират фенотипни карти, които онагледяват отделните клонове В- и Т-клетки и техните взаимоотношения в изследваната популация.
Приложението на технологията е голямо. На този етап има няколко публикации, при една от които се установява хетерогенността в моноцитна популация и тяхната склонност към диференциация в няколко определени клетъчни линии при активация, в друга изготвят каталог на мозъчните клетки на Drosophila melanogaster и измененията им с възрастта и много други.
Автор Петя Димитрова
Технология за картографиране на нуклеозомите
Анализът на генома, съчетан с изготвяне на позиционни карти на нуклеозомите се нарича картографиране на нуклеозомния “пейзаж”. Тази технология дава възможност за задълбочено изследване на регулаторната роля на нуклеозомите върху генната експресия и транскрипция.
Геномът на еукариотните клетки е пакетиран в комплекс от нуклеопротеини, наречен хроматин. Основната единица на хроматина е нуклеозомата, която включва 147 базови двойки (bp) ДНК, навити 1,65 пъти около октамер, съставен от хистонови протеини. Нуклеозомите се повтарят по дължината на целия геном, като са свързани с неопакована ДНК, наречена ДНК линкер, с дължина от няколко до над 100 bp. Установява се, че приблизително 20 bp от линкерната ДНК успява да се свърже с хистон 1 (H1), образувайки стабилен комплекс с ядрото на хистоновия октамер - така H1 и ∼165 bp от ДНК, образуват т.нар. хроматозома. Нуклеозомите създават пространствено препятствие към ДНК, като позиционирането им по протежения на целия геном се оказва важен механизъм за регулация на експресията и транскрипцията на гени.
Достъпът до пакетирана ДНК се осигурява чрез ремоделиращи фактори, които разопаковат нуклеозомна ДНК и/или приплъзват нуклеозомата по дължината на ДНК. Установено е, обаче че други протеини, освен ремоделиращите фактори, може да атакуват нуклеозомите като предизвикват т.нар. "ДНК дишане". При този процес протеините могат да се свържат за определена част от нуклеозомите, като отслабват взаимодействието между участък от ДНК и даден хистон от октамера. Така се позволява временен достъп до пакетирани ДНК региони. При in vitro изследвания се забелязва, че “ДНК дишането” настъпва на всеки ∼250 милисекунди във външните участъци на нуклеозомата (∼20 bp), което прави тези места относително достъпни за атака от протеини. При пакетирани ∼40 bp ДНК в нуклеозомата, обаче, честотата на "ДНК дишането" намалява до 10 минути и продължава да се забавя в участъци от ДНК, навиващи се около октамера, където ДНК-хистон взаимодействията стават все по-силни. Така, чрез таргетиране и атакуване на определени участъци от нуклеозомата може да се осигури “ДНК дишане” и да се регулира генната транскрипция. Например промяна в силата на свързване между няколко базови двойки и хистоните се открива скрит регулаторен елемент наречен TATA бокс, който може да промени драматично транскрипцията.
Как нуклеозомите регулират транскрипцията?
Хистоните от октамера в нуклеозомата се съревновават с различни транскрипционни фактори за свързване с ДНК последователности от промоторите на гените. Установено е, че промоторите на гени съдържат места, където нуклеозомите не могат да се свързват - наречени нуклеозомни-делетирани райони - нар. NDR. Те са разположени близо до местата за начало на транскрипцията (нар. TSS). NDR последователностите обикновено са с дължина от 150 bp, която е почти толкова, колкото мононуклеозомата, и съдържат сis-регулаторни елементи за свързване с транскрипционни фактори и TATA бокс за регулация на транскрипцията. При всички организми, NDR последователностите са оградени от две нуклеозоми - наречени well-positioned nucleosomes - една предшестваща (-2) и една последваща (+1) нуклеозома. След тези нуклеозоми следват регулярно редуващи се нуклеозоми. Позицията на последващата нуклеозома се определя от NDR и може да варира според дължината на регулаторните елементи в промоторите, може да е клетъчно-специфична и да се отдалечава от мястото за начало на транскрипцията. Така, промоторите на силно експресираните гени имат значителен брой NDR последователности, които пречат на предшестващата нуклеозома да се свърже и карат последващата нуклеозома да се измести по протежение на ДНК. Позиционирането на нуклеозомите може директно да покаже степента на транскрипция на даден ген и затова става неразделна част от анализа на нуклеозомния “пейзаж” на генома.
Фигура от публикация в Trends in Genetics
MNase нуклеозомно картографиране
Принципът на нуклеозомното картографиране е прост - използва се ензимно разграждане или химично модифициране на хроматина, за да се разруши взаимодействието между ДНК и хистоните.
Първоначално от клетките се изолират ядра. От тях се пречистват хистони и ДНК. ДНК се секвенира, като информацията се използва за генериране на референтна база данни за генома. Във втория етап отново се изолират ядра, които се третират с ензим или химични модификатори и се разрушава връзката между протените и ДНК в хроматина. Най-често се използва микрококова ендонуклеаза наречена MNase. Тя нарязва линкерния ДНК участък, свързващ отделните нуклеозоми. Нуклеазата обаче не може да среже пакетирана ДНК в нуклеозомите, понеже пространствено не достига до нея. Така ДНК в нуклеозомите остава защитена и непокътната. Последователността в защитената ДНК се анализира и се определят нуклеозомните позиции в генома след сравнение с референтната база данни (Фигура).
Фигура изработена от Петя Димитрова с BioRender софтуер
Продължителността на ензимното третиране е от важно значение за големината на получените ДНК фрагменти. При третиране на хроматин с MNase се получава набор от ДНК фрагменти, които се идентифицират след електрофореза в агарозен гел. Най-бързо мигриращият фрагмент при електрофорезата (∼147–200 bp) представлява ДНК, навита около една нуклеозома (или "мононуклеозома"), а дължината на фрагментите се увеличава кратно на броя на мононуклеозомите. При кратко ензимно третиране в пробата се откриват освен ДНК фрагменти от нуклеозоми и някои ДНК фрагменти от линкерния участък. Затова се прилага по-продължително третиране с нуклеаза и пробата се обогатява със свободни от хроматин ДНК фрагменти с размер ∼165 bp, кореспондиращи на размера на хроматозомата.
Фигура от статия в Trends in Genetics
При въвеждане на метода, мононуклеозомните ДНК фрагменти са подлагани на хибридизация с ДНК олигомери, натоварена върху чип, за да се получи маркиране на нуклеозоми в малък ДНК геномен прозорец или определен локус. Днес обаче се прилага секвениране на ДНК фрагментите. A именно от мононуклеозомните ДНК фрагменти се отстранят хистони и други ДНК-свързващи протеини, а ДНК фрагментите се екстрахират с фенол-хлороформ и се подлагат на електрофореза в агарозен гел. След това ДНК фрагменти с размер 145 bp се изолират, пречистват и се конструират библиотеки, които се секвенират чрез paired-end техника (секвениране със сдвояване на крайщата на фрагментите, използвано от Illumina). При тази техника секвенирането започва едновременно от двата противоположни края към центъра на фрагмента. На практика последователностите в центъра на фрагмента съвпадат с ДНК последователностите, идентифицирани в центъра на нуклеозомата. Въз основа на тази информация се определят позициите на защитената ДНК в генома и се идентифицира центъра на нуклеозомите. Данните се наслагват върху реферетните данни от секвенирането на целия геном и след това се изготвят позиционни карти, описващи нуклеозомния “пейзаж”.
Допълнителна литература:
1. Iyer, Vishwanath R. Nucleosome positioning: bringing order to the eukaryotic genome.Trends in Cell Biology, Volume 22, Issue 5, 250 - 256
2. Voong, Lilien N. et al. Genome-wide Mapping of the Nucleosome Landscape by Micrococcal Nuclease and Chemical Mapping.Trends in Genetics, Volume 33, Issue 8, 495 - 507
Научете повече от лекцията на проф. Rob Edwards
Автор Петя Димитрова
CUT&RUN метод за картографиране на хроматин-свързващи протеини в генома
Охарактеризирането на клетъчните функции на молекулярно ниво може да включва определяне на местоположението на ДНК-свързващи протеини в специфични региони на генома или в целия геном.
Имунопреципитацията на хроматин-свързани протеини (chromatin immunoprecipitation), наречена ChIP е широко използвана техника за определяне на местата на свързани протеини (транскрипционни фактори или хистони) в определени участъци от ДНК (Raha, Hong, & 2010). При този метод се използва формалдехид, който кръстосано свързва и фиксира протеин-ДНК комплекси. След това хроматина се накъсва неспецифично чрез ултразвук до ~500 bp ДНК фрагменти, свързани с протеини. Следва имунопреципитация на протеини със специфично антитяло, което се имобилизира върху магнитни или агарозни частици (натоварени с протеин А или G агароза). Протеините все още са свързани с ДНК и затова ДНК се изолира, изготвят се библиотеки и се подлагат на секвениране - техниката се нарича ChiP seq.
Steven Henikoff и неговите колеги обаче доразвиват тази методика и я наричат Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease (CUT) & RUN техника (Виж Фигура). Този метод позволява картографиране на местата на ДНК-свързващи протеини по протежение на целия геном. Ядрата на клетката се изолират и имобилизират, като се използват магнитни частици, натоварени с лектин. Както при ChIP метода, ДНК-свързанитe протеини, хистони или транскрипционни фактори, се разпознават с помощта на специфично антитяло. Добавя се протеин А, свързан с бактериална нуклеаза - MNase. Протеин А се свързва със специфичното антитяло, а нуклеазата се привлича и позиционира близо до ДНК, обхващаща протеин-свързващото място. Eнзимът се активира след добавяне на Са2+ и ДНК се срязва до 25-50 bp къси ДНК фрагменти (или единични локуси на свързване). Те се предпазват от действието на нуклеазата чрез последващо добавяне на хелаторни комплекси и напускане на ядрото. ДНК фрагментите се изолират, изготвят се библиотеки и се секвенират чрез paired-end техниката на сдвояване на краищата. От данните се генерират карти на целия геном с висока резолюция, които показват местата на хроматин-свързващи протеини и се изработва общ отпечатък, както и се идентифицират отделни индивидуални мотиви, информативни за мястото на директно свързване на определен транскрипционен фактор или хистон.
CUT&RUN техниката е изключително чувствителна и води до интензивно обогатяване на изследваните хроматин-свързани протеини. По отношение на ДНК фрагментите не се изисква промяна и обогатяване в рамката на четене по време на секвениране, защото фрагментите са къси и с почти с еднакви размери. Самата техника се изпълнява бързо и лесно и изисква по-малко количество ядра и съответно клетки от ChIР техниката.
Допълнителна литература:
1. Skene P, Henikoff J. & Henikoff S (2018). Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers. Nat Protoc 13, 1006–1019. https://doi.org/10.1038/nprot.2018.015
2. Hainer S.J. & Fazzio T.G. (2019). High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Current Protocols in Molecular Biology, 126, e85. doi: 10.1002/cpmb.85
